Skip to content

Warianty genetyczne w C5 i słaba odpowiedź na Eculizumab AD 3

2 miesiące ago

396 words

Wszystkie próbki krwi pobrano za pomocą nakłucia żylnego. Testy hemolityczne
Ustaliliśmy odpowiedź farmakodynamiczną na ekulizumab poprzez pomiar zdolności surowicy pacjentów do lizy erytrocytów kurzych uczulonych przeciwciałem w teście hemolitycznym z udziałem ludzkich surowic12. Mniejsza niż 20% resztkowa hemoliza wskazuje na całkowitą blokadę hemolizy w tym układzie oznaczenia . W niektórych testach hemolitycznych zamiast ekulizumabu stosowano monoklonalne przeciwciało monoklonalne anty-C5, N19-8.
Sekwencjonowanie genów C5
Genomowy DNA wyizolowano z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej za pomocą zestawu DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen), a informacyjny RNA (mRNA) wyizolowano z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej za pomocą QIAamp RNA Blood Mini Kit (Qiagen ). Zsyntetyzowaliśmy komplementarny DNA (cDNA) z mRNA przy użyciu wysokojakościowych zestawów do odwrotnej transkrypcji cDNA (Applied Biosystems).
Gen C5 składa się z 41 eksonów, które łącznie zawierają 97 942 par zasad. Aby objąć każdy ekson, zaprojektowaliśmy 41 specyficznych zestawów primerów w intronach flankujących każdy z 41 egzonów zgodnie z sekwencjami genów C5 zgłoszonymi w bazie danych GenBank (numer dostępu GenBank, NG_007364.1). Sekwencje starterów dla eksonu 21, który zawiera zidentyfikowane mutacje, pokazano na Rys. S1 w Dodatku Uzupełniającym (dostępnym w). Całkowity genomowy DNA został użyty jako matryca i został zamplifikowany za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Sekwencję zamplifikowanych fragmentów przeprowadziliśmy za pomocą tej samej pary primerów, używając BigDye Terminator, wersja 1.1, zestaw do sekwencjonowania cyklicznego (Applied Biosystems).
Screening for Mutations in C5
W celu określenia częstości występowania heterozygotycznej mutacji punktowej, c.2654G . A, w zdrowej japońskiej populacji, produkt PCR (185 bp) pochodzący z krwi obwodowej dla sekwencji nukleotydowych w eksonie 21 strawiono przy użyciu enzymu restrykcyjnego ApaLI. i strawione próbki rozdzielono za pomocą elektroforezy w 2% żelu agarozowym. Aby przeanalizować rozkład zidentyfikowanych wariantów, c.2654G . A i c.2653C . T, w różnych populacjach, zsekwencjonowaliśmy produkt PCR przy użyciu metody Sangera. Dodano panele DNA zawierające próbki otrzymane od 100 osób z Anglii i Szkocji (panel MGP00003), 120 Chińczyków Han (panel MGP00017) i 90 osób w Los Angeles, którzy byli meksykańskimi przodkami (HapMap [wydanie 13]) (Instytut Coriella dla Badania medyczne).
Generacja rekombinowanego C5
Rekombinowany, niezmutujący ludzki C5 (rC5) uzyskano z niezmutowanego genu sklonowanego w wektorze ekspresyjnym, pEE12.4. Zrekombinowany mutant C5 (rC5m) utworzono z rC5 za pomocą ukierunkowanej mutagenezy (zestaw Stratagene QuikChange Lightning, Agilent Technologies)
[podobne: bóle neuralgiczne, zus sanatoria lista oczekujących, stomatologia mokotów ]

Powiązane tematy z artykułem: bóle neuralgiczne stomatologia mokotów zus sanatoria lista oczekujących